稀疏標(biāo)記系統(tǒng)工作原理

15個(gè)多巴胺神經(jīng)元的全腦投射形態(tài)重構(gòu)

就像廣袤無(wú)垠的宇宙中有無(wú)數(shù)星體，人類大腦中分布著千億數(shù)量的神經(jīng)元，它們“雜亂無(wú)章”地分布且相互連接，發(fā)揮著感受刺激和傳導(dǎo)興奮的作用。這些決定人類思考能力的大腦神經(jīng)元究竟是怎么連接的？這個(gè)問(wèn)題自神經(jīng)生物學(xué)興起以來(lái)一直懸而未解。

過(guò)去，神經(jīng)生物學(xué)家們已經(jīng)描繪了大腦中不同腦區(qū)之間以及不同位置神經(jīng)元類群之間的連接，但尚未認(rèn)識(shí)到單個(gè)細(xì)胞精度下的連接方式，這阻礙了對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的精細(xì)認(rèn)識(shí)以及一些疾病的精準(zhǔn)治療。

近日，北京生命科學(xué)研究所教授羅敏敏團(tuán)隊(duì)以及華中科技大學(xué)教授龔輝團(tuán)隊(duì)合作，完整重構(gòu)了全腦范圍內(nèi)單神經(jīng)元連接圖譜，并獲得了高精度的全腦成像。相關(guān)成果發(fā)表在《自然-方法》上。

從“一團(tuán)”到單個(gè)

大腦中的神經(jīng)元呈“抱團(tuán)取暖”狀，且“團(tuán)”的規(guī)模稀疏有別，將它們相互連接的是軸突，如電線般又密又細(xì)且互相“纏繞”。

“要想清晰分辨單神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)，理清哪條‘線’連接哪兩個(gè)神經(jīng)元，需要對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行稀疏且高亮地標(biāo)記。”羅敏敏告訴《中國(guó)科學(xué)報(bào)》記者。

最早的稀疏標(biāo)記方法是諸如高爾基染色法等的化學(xué)法，一直沿用至今，這些方法使人們認(rèn)識(shí)了大腦存在大量且種類不同的神經(jīng)元。但其缺點(diǎn)在于“一染一大片”，不具有選擇性，無(wú)法獲知不同神經(jīng)元在基因、蛋白等方面的區(qū)別。

近年來(lái)，“玻璃電極”標(biāo)記法逐漸興起，想要研究某個(gè)細(xì)胞，就將電極插入該細(xì)胞內(nèi)，注射染料進(jìn)行標(biāo)記，但該方法只能“看到一個(gè)標(biāo)記一個(gè)”，難以操作且效率低。

此外，根據(jù)已有的標(biāo)記方法，科學(xué)家們可清楚看到某個(gè)腦區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞“團(tuán)”的軸突大概伸出的方向，但問(wèn)題在于每個(gè)“團(tuán)”里還存在著大量不一樣的神經(jīng)元，它們軸突的特征不清楚。

“傳統(tǒng)標(biāo)記方法呈現(xiàn)的圖譜很粗糙”，論文第一作者、北京生命科學(xué)研究所博士林睿形象地舉了個(gè)例子，“就像我們知道可以開(kāi)車從北京A地到B地，但實(shí)際上兩地之間有許多不同的路，有的遠(yuǎn)，有的近。”

為何要執(zhí)著于描繪單細(xì)胞精度的連接？林睿同樣以路類比，“從A地到B地，整體上看不堵車，但實(shí)際有些路非常堵。同樣地，在進(jìn)行神經(jīng)退行性疾病檢測(cè)時(shí)，大范圍看，1萬(wàn)個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞好像沒(méi)什么問(wèn)題，但其中的100個(gè)細(xì)胞很可能已經(jīng)有早期的病變現(xiàn)象，而傳統(tǒng)方法無(wú)法捕捉到這些信息。”

林睿還提到，目前神經(jīng)生物學(xué)研究大多通過(guò)大腦切片的方式，只能看到單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的部分形態(tài)而非全貌，解決該問(wèn)題還需要高精度高通量的自動(dòng)化光學(xué)成像系統(tǒng)來(lái)獲得全腦成像，從而進(jìn)行神經(jīng)元細(xì)胞的完整重構(gòu)。

特異性標(biāo)記：“指哪打哪”

在對(duì)神經(jīng)元的研究中，稀疏特異性標(biāo)記與高亮度成像兩者同時(shí)實(shí)現(xiàn)，一直是難以跨越的“鴻溝”。

“特異性選擇是為獲得我們感興趣的神經(jīng)元細(xì)胞，它們對(duì)某些行為或病理有某些特定的功能，而高亮成像是為了在光學(xué)顯微鏡下更清晰地看到軸突延伸的方向以及長(zhǎng)度”，林睿說(shuō)。

為解決這一矛盾，研究人員引入了兩個(gè)腺相關(guān)病毒（AAV），一個(gè)名為“控制子（Controller）”，負(fù)責(zé)控制降低標(biāo)記細(xì)胞的個(gè)數(shù)；另一個(gè)名為“放大子（Amplifier）”，負(fù)責(zé)增加標(biāo)記亮度。將兩個(gè)病毒混合后注射到小鼠腦內(nèi)感興趣的細(xì)胞上，混合病毒便會(huì)侵染神經(jīng)元，進(jìn)行特異性標(biāo)記。通過(guò)調(diào)整“控制子”和“放大子”的混合比例，控制標(biāo)記的稀疏程度。

利用基于兩個(gè)腺相關(guān)病毒的稀疏標(biāo)記系統(tǒng)，羅敏敏課題組與華中科技大學(xué)國(guó)家光電研究中心fMOST課題組合作，借助其熒光顯微光學(xué)切片斷層掃描平臺(tái)，建立了“細(xì)胞特異性稀疏標(biāo)記—高分辨率全腦形象-神經(jīng)元形態(tài)學(xué)重建-量化分析”的流水線，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高通量的全腦成像和圖像分析。

在這一流水線上，研究人員在3個(gè)DAT-Cre小鼠中重構(gòu)了15個(gè)中腦多巴胺神經(jīng)元的完整形態(tài)。經(jīng)分析，研究人員認(rèn)為重構(gòu)的多巴胺神經(jīng)元有兩種投射模式：其中10個(gè)多巴胺神經(jīng)元軸突只有單個(gè)投射目標(biāo)，它們?cè)诮K點(diǎn)處會(huì)形成小而密集的末端樹(shù)狀分支；另外5個(gè)則分布更為廣泛，會(huì)有多個(gè)分支投向不同目標(biāo)。

共享開(kāi)放的平臺(tái)

“大腦是復(fù)雜的，神經(jīng)生物學(xué)的研究越來(lái)越細(xì)化。這項(xiàng)研究讓我們對(duì)單個(gè)神經(jīng)元細(xì)胞的特異性信息有了一個(gè)更清晰的認(rèn)識(shí)。”他們?cè)谘芯恐袑ｉT考慮到標(biāo)記方法的兼容性，使用了轉(zhuǎn)基因小鼠，這適用于幾乎所有大腦區(qū)域的大多數(shù)主要細(xì)胞類型。

這樣做的好處在于，如果其他研究人員想用這個(gè)方法，用他們感興趣的轉(zhuǎn)基因小鼠，直接用這兩個(gè)病毒來(lái)標(biāo)記他們想要研究的神經(jīng)元即可。

羅敏敏告訴記者，不同研究人員可利用這個(gè)方法對(duì)小鼠的各個(gè)腦區(qū)不同神經(jīng)元進(jìn)行普查，建立單細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)庫(kù)，“這樣，我們可以了解帕金森、阿茲海默等病癥發(fā)病的早中晚期在單個(gè)細(xì)胞形態(tài)上的變化。”

未來(lái)，他們期望這一稀疏標(biāo)記系統(tǒng)被更多感興趣的研究者所使用，“大腦神經(jīng)元太多了，不是我們重構(gòu)一、兩千個(gè)就夠了，需要更多的人來(lái)做，同時(shí)結(jié)合算法把數(shù)據(jù)處理的效率提上去。”林睿說(shuō)。